Como comprovar identidade, pureza e teor de peptídeos por LC-MS: tirzepatida, retatrutida e GHK-Cu

Em 21 de janeiro de 2026, a Anvisa determinou a apreensão de lotes de tirzepatida das marcas Synedica e TG e de toda retatrutida, de qualquer marca ou lote. Eram produtos de fabricantes desconhecidos, vendidos por perfis no Instagram e sem nenhuma garantia de conteúdo (Anvisa, 21/01/2026).

Para quem compra ou libera matéria-prima peptídica, seja uma importadora, uma indústria ou uma farmácia de manipulação, a lição não se resume a desconfiar do fornecedor. O ponto é que um certificado com "99% por HPLC" responde uma de três perguntas. Este guia mostra como fechar as três (identidade, pureza e teor) e o que exigir no laudo, usando tirzepatida, retatrutida e GHK-Cu como exemplos. Se você está começando pelo tema, veja também como a Percevia trata avaliação de pureza e qualidade.

Principais conclusões

• Identidade, pureza e teor são ensaios diferentes: LC-HRMS (massa intacta), RP-HPLC-UV (% área) e LC-AAA ou nitrogênio (% m/m). Nenhum substitui o outro.
• Um estudo publicado no JMIR em 2024 encontrou frascos "99%" com um único pico no cromatograma e só 7,7% a 14,4% de ativo na massa do pó.
• Na tirzepatida, a desamidação (+0,984 Da) se esconde no envelope isotópico da massa intacta. Quem a revela é a separação cromatográfica.
• Aib e α-metil-leucina não estão na calibração padrão da análise de aminoácidos, então o teor de GLP-1 sintético exige um método adaptado.
• No GHK-Cu, o LC-MS enxerga o tripeptídeo. O cobre e a razão molar 1:1 dependem de ICP.

Identidade, pureza e teor: por que são três ensaios diferentes?

Cada ensaio responde uma pergunta. Identidade: é esta a molécula? Pureza: da parte peptídica, quanto é a molécula-alvo? Teor: quantos miligramas de peptídeo há em cada miligrama de pó? Um laudo que traz só um desses números deixa as outras duas perguntas em aberto.

O caso mais claro de confusão entre esses números vem de um estudo de compra controlada. Ashraf e colaboradores, no Journal of Medical Internet Research (2024), compraram semaglutida liofilizada de vendedores online sem receita e analisaram os frascos por LC-MS (Ashraf et al., JMIR 2024;26:e65440). Os três frascos recebidos declaravam 99% de pureza, e o cromatograma de cada um mostrou um único sinal, sem impurezas peptídicas.

Mesmo assim, a semaglutida representava só 7,7%, 8,97% e 14,37% da massa de pó. Em dois frascos, a dose de ativo chegou a ficar 29% e 39% acima do rótulo. O ativo estava lá, e a massa desconhecida em volta dele também. Os autores ainda relataram endotoxina em todas as amostras, com máximo de 8,95 EU/mg.

O "99%" desses frascos era verdadeiro como pureza cromatográfica e falso como teor. Quem lê um CoA sem distinguir as duas coisas aprova um lote assim.

Passo 1: como confirmar a identidade por massa intacta?

Ao fim deste passo você tem a massa monoisotópica observada, comparada à teórica com erro em ppm, e a sequência conferida por fragmentação.

1. Meça em alta resolução (QTOF ou Orbitrap), não em triplo quadrupolo. A tirzepatida (C₂₂₅H₃₄₈N₄₈O₆₈, com Aib nas posições 2 e 13 e cadeia C20 na Lys20, segundo a bula do Mounjaro na FDA) ioniza em ESI como um envelope de cargas. No íon 5+, os picos isotópicos ficam a 0,20 m/z um do outro, e separá-los em m/z 963 exige resolução de cerca de 5.000. Um QTOF faz isso com folga. Um triplo quadrupolo em resolução unitária não faz, e sem resolver os isótopos não dá para atribuir a carga nem a massa monoisotópica com precisão de ppm.
2. Compare os íons observados com os calculados. Valores monoisotópicos calculados a partir das fórmulas do KEGG (tabela a seguir).
3. Use a diferença entre moléculas parecidas como teste de troca. Tirzepatida e retatrutida diferem em 82,05 Da. Um frasco rotulado como uma que contenha a outra é reconhecido já no primeiro espectro, sem depender de padrão.
4. Confirme a sequência por MS/MS. A fragmentação localiza os resíduos não naturais (Aib; na retatrutida, também α-metil-leucina na posição 13) e o ponto de ligação da cadeia graxa: Lys20 na tirzepatida, Lys17 na retatrutida.

Verificação: a massa desconvoluída fica dentro do critério em ppm declarado no laudo, o padrão isotópico é coerente com a fórmula, e o tempo de retenção coincide com o do padrão de referência. Esse é o trabalho de uma análise LC-QTOF ou LC-Orbitrap.

Passo 2: como medir a pureza de um peptídeo de 39 resíduos?

Ao fim deste passo você tem a % de área do pico principal e a lista de impurezas relacionadas acima do limite de relato, obtidas numa condição cromatográfica capaz de separá-las.

A pureza de peptídeo é medida por RP-HPLC com detecção UV a 214 nm, onde absorve a ligação peptídica. É a coluna, e não o detector, que define o que você enxerga.

1. Escolha coluna de poro largo. Uma molécula de 4,8 kDa pede C18 ou C8 de 300 Å, ou C4. Colunas de 100 Å, feitas para moléculas pequenas, restringem o acesso ao poro e alargam os picos, e impurezas próximas somem na base do pico principal. A etapa de LC-UV/DAD é onde isso se decide.
2. Assuma que haverá impurezas isobáricas. A isomerização de Asp em isoAsp (a tirzepatida tem Asp nas posições 9 e 15) e os epímeros D formados na síntese têm a mesma massa do peptídeo. Nenhum espectrômetro os distingue, só a separação. Deleções de um resíduo, truncados e desamidação completam o perfil.
3. Planeje um método ortogonal. O guia de peptídeos sintéticos da EMA (2025) pede métodos capazes de atender ao limite de relato de 0,1% e prevê mais de um procedimento quando um só não separa todas as impurezas relacionadas. Na prática, isso significa um segundo pH, outra fase estacionária, HILIC ou troca iônica.
4. Identifique os picos por LC-MS. O UV quantifica e o MS diz o que é cada impureza acima do limite de identificação.

Os limites que o laudo deve respeitar vêm da farmacopeia e das agências. Pela monografia geral 2034 da Farmacopeia Europeia, citada no guia da EMA, impurezas relacionadas a peptídeo são relatadas acima de 0,1%, identificadas acima de 0,5% e qualificadas acima de 1,0%. O guia da FDA de 2021 para ANDAs de cinco peptídeos sintéticos é mais rígido: pede identificar e caracterizar toda impureza entre 0,10% e 0,5%, e uma impureza nova acima de 0,5% não é aceita. A tirzepatida não está entre os cinco, mas a própria FDA indica que os princípios podem valer para outros peptídeos conforme o risco.

Verificação: o laudo traz o cromatograma com coluna, comprimento de onda, gradiente e LOQ ≤ 0,1%, e as impurezas acima de 0,1% vêm listadas com tempo de retenção relativo.

Passo 3: como fechar o teor em % m/m?

Ao fim deste passo você sabe quantos miligramas de peptídeo há em cada miligrama de pó, e com isso corrige a dose.

O pó liofilizado não é só peptídeo. Ele carrega contraíon (TFA ou acetato), água e sais residuais. Segundo a AltaBioscience, laboratório britânico especializado em peptídeos, o teor líquido típico fica entre 70% e 90%. A análise quantitativa de aminoácidos é o método que determina esse número (AltaBioscience, consultado em 28/09/2026). Num cenário ilustrativo, com valores dentro dessa faixa, um frasco com 99% de pureza HPLC se decompõe assim:

1. Quantifique por análise de aminoácidos. O peptídeo é hidrolisado em HCl 6 M, e os aminoácidos são separados por troca iônica e detectados com ninidrina (LC-AAA).
2. Adapte o método aos GLP-1 sintéticos. São quatro armadilhas específicas: • Aib e α-metil-leucina não fazem parte da calibração padrão. • O Aib pode coeluir com o ácido α-aminobutírico (AABA), comum como padrão interno. Peça norleucina como padrão interno. • O triptofano (Trp25 na tirzepatida) é destruído na hidrólise e não serve para calcular o teor. • Asn e Gln viram Asp e Glu (relate Asx e Glx), e o espaçador AEEA e a cadeia C20 não aparecem. Calcule o teor a partir dos resíduos estáveis e bem recuperados.
3. Feche o balanço de massa. Complete com nitrogênio elementar, contraíon por cromatografia iônica e água por Karl Fischer. Peptídeo, contraíon, água e resíduos devem somar perto de 100%.

Verificação: o laudo informa o método, o padrão interno, os resíduos usados no cálculo e o balanço de massa. A massa real de peptídeo é a massa pesada × teor, e é esse número que entra no cálculo da dose.

GHK-Cu: o que muda quando o peptídeo tem três resíduos e um metal?

No GHK-Cu, confirmar a massa é o passo fácil. O trabalho está em reter o tripeptídeo na coluna e em provar o complexo com o cobre.

O GHK livre (C₁₄H₂₄N₆O₄) tem massa monoisotópica de 340,19 Da e aparece como [M+H]⁺ em m/z 341,19. Por ser muito polar, ele quase não é retido em C18 e pede HILIC ou reagente de par iônico. O complexo cosmético (INCI copper tripeptide-1) é 1:1 com Cu²⁺. Em pH ácido, típico de fases móveis de LC-MS, os sítios de coordenação ficam protonados e o cobre tende a se dissociar. O espectro, então, confirma o peptídeo, mas não prova que o cobre estava ligado na proporção certa.

O laudo de GHK-Cu precisa de três números:

• identidade e pureza do GHK por LC-MS;
• cobre total por ICP-OES ou ICP-MS;
• a razão molar Cu:GHK calculada a partir dos dois, que deve ser próxima de 1:1.

O uso pretendido pesa aqui. A FDA mantém o GHK-Cu para vias injetáveis na categoria 2 de insumos para manipulação, citando risco de imunogenicidade por agregação e por impurezas relacionadas a peptídeo (FDA). Na atualização de maio de 2026, as vias não injetáveis voltaram à categoria 1, e a agência prevê consultar seu comitê consultivo antes do fim de fevereiro de 2027 (FDA). Para cosméticos, identidade, pureza e cobre bastam na maioria dos casos. Para qualquer uso injetável, o perfil de impurezas e agregados passa a ser o centro da análise.

Retatrutida: como analisar uma molécula sem monografia?

A retatrutida não tem registro em nenhum país. Em 23 de julho de 2026, a Eli Lilly divulgou resultados positivos dos estudos de fase 3 TRIUMPH-2 e TRIUMPH-3. A empresa pretende submeter o pedido à FDA no primeiro trimestre de 2027 (Eli Lilly). No Brasil, a Anvisa proibiu a comercialização, a importação e o uso de retatrutida de todas as marcas e lotes.

Sem produto aprovado, não existe monografia farmacopeica. A análise, portanto, é um relatório de caracterização contra o padrão de referência (com origem e lote rastreáveis), nunca um ensaio "conforme USP" ou "conforme Ph. Eur.". Os usos legítimos são pesquisa, qualificação de insumo em P&D autorizado e investigação de material suspeito ou apreendido. Um laudo não torna o produto comercializável no Brasil.

Tecnicamente, a retatrutida soma dois Aib e uma α-metil-leucina à cadeia graxa C20 ligada por AEEA-γGlu, e termina em serinamida (que libera amônia extra na hidrólise). Valem as mesmas precauções de teor do Passo 3, com mais atenção à calibração. Para triagem de material desconhecido, a identificação de materiais começa pela massa intacta.

Quais erros mais comprometem um laudo de peptídeo?

1. Aceitar "99% HPLC" como teor. Pureza é razão de áreas e teor é razão de massas. Peça os dois números, com métodos separados.

2. Confirmar identidade em triplo quadrupolo. Sem resolução isotópica não há massa monoisotópica confiável para um peptídeo de 4,8 kDa. Exija HRMS e o erro em ppm.

3. Usar coluna de molécula pequena. Uma C18 de 100 Å esconde impurezas na base do pico. Peça 300 Å ou C4 e a justificativa da condição.

4. Tratar a massa intacta como prova de integridade. Desamidação, isoAsp e epímeros D passam despercebidos na massa intacta. É a separação cromatográfica, com método ortogonal, que os revela.

5. Rodar análise de aminoácidos padrão em GLP-1 sintético. Aib e α-metil-leucina ficam fora da calibração, e o padrão interno AABA pode interferir. Peça norleucina e o cálculo por resíduos estáveis.

O que exigir no laudo de um peptídeo sintético?

Um laudo que fecha as três perguntas traz:

• Identidade: massa desconvoluída observada × teórica, com erro em ppm, espectro anexado e instrumento identificado (QTOF ou Orbitrap).
• Sequência: MS/MS com cobertura de fragmentos, quando a aplicação exigir.
• Pureza: cromatograma a 214 nm com coluna (poro), gradiente, LOQ ≤ 0,1% e lista de impurezas acima de 0,1%.
• Ortogonalidade: um segundo método ou a justificativa de que um só basta.
• Teor: método (AAA ou nitrogênio), padrão interno, contraíon, água e balanço de massa.
• GHK-Cu: cobre por ICP e razão molar Cu:GHK.
• Padrão de referência: origem, lote e certificado.

Se o CoA da sua tirzepatida ou do seu GHK-Cu traz só "99% por HPLC", o primeiro número que falta é a massa intacta em alta resolução. Solicite uma análise LC-QTOF de identidade de peptídeo e receba o espectro desconvoluído com erro em ppm, pronto para anexar ao dossiê do lote.

Conclusão

Identidade por massa intacta em alta resolução, pureza por RP-HPLC-UV em coluna de poro largo e teor por análise de aminoácidos adaptada: são três laudos diferentes. Um frasco com pico único e menos de 15% de ativo passa em um deles e reprova nos outros. Para aprofundar a escolha de técnica por pergunta analítica, veja a página de avaliação de pureza e qualidade.

Sobre a autoria. Artigo da equipe técnica da Percevia, parceira analítica de P&D e controle de qualidade com acesso a LC-HRMS, análise de aminoácidos e ICP em uma rede de centrais analíticas. Revisão técnica: [NOME, FORMAÇÃO]. Dúvidas sobre um caso específico: fale com a equipe.

Referências

1. 01Anvisa. Canetas emagrecedoras: lotes de Tirzepatida das marcas Synedica e TG estão proibidos e devem ser apreendidos. 21/01/2026. https://www.gov.br/anvisa/pt-br/assuntos/noticias-anvisa/2026/canetas-emagrecedoras-lotes-de-tirzepatida-das-marcas-synedica-e-tg-estao-proibidos-e-devem-ser-apreendidos
2. 02Ashraf AR, Mackey TK, Vida RG, et al. Multifactor Quality and Safety Analysis of Semaglutide Products Sold by Online Sellers Without a Prescription. J Med Internet Res. 2024;26:e65440. https://doi.org/10.2196/65440
3. 03FDA. Mounjaro (tirzepatide) prescribing information, 2022. https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2022/215866s000lbl.pdf
4. 04KEGG DRUG. Tirzepatide (D11360) e Retatrutide (D12430). https://www.kegg.jp/entry/D11360 · https://www.kegg.jp/entry/D12430
5. 05EMA. Guideline on the Development and Manufacture of Synthetic Peptides. 2025. https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-development-manufacture-synthetic-peptides_en.pdf
6. 06FDA. ANDAs for Certain Highly Purified Synthetic Peptide Drug Products That Refer to Listed Drugs of rDNA Origin (2021), apresentação de esclarecimentos. https://www.fda.gov/media/166571/download
7. 07AltaBioscience. Peptide Synthesis, Purification and Product Analysis. Consultado em 28/09/2026. https://altabioscience.com/articles/peptide-synthesis-purification-and-product-analysis
8. 08FDA. Certain Bulk Drug Substances for Use in Compounding that May Present Significant Safety Risks. https://www.fda.gov/drugs/human-drug-compounding/certain-bulk-drug-substances-use-compounding-may-present-significant-safety-risks
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10. 10Eli Lilly and Company. Lilly's triple agonist, retatrutide, successful in two additional Phase 3 obesity trials. 23/07/2026. https://investor.lilly.com/news-releases/news-release-details/lillys-triple-agonist-retatrutide-successful-two-additional