Analyse des nitrosamines : détection et quantification des impuretés génotoxiques
L'analyse des nitrosamines est la détection et la quantification à l'état de traces des N-nitrosamines classées comme cancérogènes probables pour l'homme dans les API, les excipients et les produits pharmaceutiques finis. L'étude combine LC-MS/MS et GC-MS pour mesurer chaque nitrosamine par rapport à sa limite d'apport journalier acceptable, soutenant l'évaluation des risques ICH M7, la libération des lots et la soumission réglementaire.
Qu’est-ce que l’analyse des nitrosamines ?
Les nitrosamines sont des composés N-nitroso formés lorsqu'une amine secondaire ou tertiaire réagit avec un agent nitrosant, un nitrite résiduel ou des sous-produits générés dans des conditions acides. Plusieurs sont classés comme cancérogènes probables pour l'homme, c'est pourquoi la FDA, l'EMA et d'autres régulateurs exigent une évaluation des risques et, lorsque cela est justifié, une quantification en parties par milliard dans les produits médicamenteux.
Le risque ne se limite pas à la synthèse d’API. Les nitrosamines peuvent également se former par interaction entre l'actif, les excipients et les matériaux d'emballage, ou par dégradation pendant le stockage, le cas le plus connu étant la formation de NDMA dans la ranitidine au cours de la durée de conservation, sans rapport avec le processus de fabrication d'origine.
L'analyse combine deux couches : une évaluation documentaire des risques, qui identifie si la voie de synthèse, les excipients ou le processus de fabrication créent un potentiel de formation, et une couche analytique, quantification par spectrométrie de masse à l'état de traces, lorsque le risque identifié nécessite une confirmation expérimentale.
Nitrosamines surveillées et limites de référence
Sept à huit composés représentent la plupart des cas réglementaires documentés à ce jour. Chacun a sa propre limite de dose journalière admissible (AS), fixée à partir d’une évaluation des risques de cancérogénicité.
| Composé | Nom | IA de référence |
|---|---|---|
| NDMA | N-nitrosodiméthylamine | 96 ng/jour |
| NDEA | N-nitrosodiéthylamine | 26,5 ng/jour |
| NMBA | Acide N-nitroso-N-méthyl-4-aminobutyrique | 96 ng/jour |
| NDIPA | N-nitrosodiisopropylamine | 26,5 ng/jour |
| NEIPA | N-Nitrosoéthylisopropylamine | 26,5 ng/jour |
| NMPA | N-nitrosométhylphénylamine | 26,5 ng/jour |
| NDBA | N-nitrosodibutylamine | 26,5 ng/jour |
Valeurs de référence les plus fréquemment citées dans les directives de la FDA. Les limites sont révisées périodiquement et peuvent varier selon l'autorité réglementaire et le produit ; l'évaluation des risques dans l'étude applique toujours la valeur actuelle dans les directives applicables.
De la technique à la décision
Le choix de la méthode dépend de la volatilité et de la polarité de la nitrosamine cible ainsi que de la matrice du produit. Aucune technique n’entre dans le champ d’application sans répondre à une question soulevée par l’évaluation des risques.
| Technique | Ce qu'il mesure | Quelle décision il soutient |
|---|---|---|
| LC-MS/MS | Des nitrosamines polaires et non volatiles à l'état de traces, directement dans l'API, l'excipient ou le produit fini, cas typique des sartans et de la metformine. | Si un lot spécifique se situe dans la limite de dose journalière acceptable pour la nitrosamine en question. |
| GC-MS (espace de tête) | Nitrosamines volatiles par échantillonnage de l'espace de tête, sans extraction matricielle approfondie. | Si une nitrosamine volatile est présente sans le risque d'interférence qu'une extraction liquide entraînerait. |
| Chromatographie · Prise en charge HPLC/UPLC | Séparation de la nitrosamine cible des excipients et des produits de dégradation avant la détection de masse. | Indique si la matrice du produit nécessite une étape de séparation supplémentaire pour éviter un faux négatif ou une suppression du signal. |
| Validation de la méthode analytique | Spécificité, linéarité, exactitude, précision, limite de détection et limite de quantification de la méthode, par rapport à la matrice du produit réel. | Si la méthode est suffisamment sensible pour quantifier de manière fiable en dessous de la limite de dose journalière acceptable, et pas seulement en dessous d'une limite générique de laboratoire. |
Le flux de travail analytique
Chaque produit suit la même séquence logique, avec un périmètre d'analyse adapté au risque identifié dès la première étape ; tous les produits évalués ne nécessitent pas une quantification expérimentale.
Évaluation des risques documentaires (ICH M7)
Revue critique de la voie de synthèse des API, des précurseurs porteurs d'une amine secondaire ou tertiaire, des agents nitrosants potentiels, des excipients, du procédé de fabrication et des conditions de stockage. Classifie le potentiel de formation de nitrosamine du produit avant tout essai sur banc.
Rapport d'évaluation des risques
Développement et validation de méthodes
Une méthode LC-MS/MS ou GC-MS spécifique à la nitrosamine et à la matrice produit, avec sélectivité sur le reste de la formulation. Validation de la spécificité, de la linéarité, de l'exactitude, de la précision et de la sensibilité (LOD/LOQ) aux exigences réglementaires applicables.
Une méthode validée, avec une sensibilité tracée jusqu'à la limite d'apport acceptable
Quantification confirmative
Quantification à l'état de traces de chaque nitrosamine signalée comme risque, par lot ou par point d'étude de stabilité, le résultat étant exprimé en concentration et converti en apport quotidien à partir de la dose maximale de produit.
Résultat quantitatif par nitrosamine, en ng/g et ng/jour
Interprétation et support réglementaire
Comparaison de chaque résultat avec la limite d'apport journalier acceptable actuelle, discussion des causes profondes le cas échéant et preuves organisées dans le format requis pour la soumission à l'ANVISA, à la FDA ou à l'EMA.
Un rapport interprété, avec un avis de conformité
Applications
La même capacité analytique prend en charge des fronts distincts de risque et de décision réglementaire.
Risque de synthèse
API avec des amines secondaires ou tertiaires
Sartans, metformine et autres classes dont la voie de synthèse ou l'historique réglementaire a déjà lié l'API à la formation de nitrosamine.
Génériques et similaires
Dossier d'enregistrement et libération des lots
Preuves quantitatives au niveau des lots pour soutenir l'ANVISA ou tout autre enregistrement réglementaire et libération de routine, avec des résultats rattachés à la limite d'absorption acceptable du produit.
CDMO et fabricants sous contrat
Évaluation des risques liés aux nouveaux processus
Évaluation documentaire avant le début de la production commerciale, identifiant les précurseurs et les étapes de processus présentant un potentiel de formation.
Stabilité
Formation pendant le stockage
Enquête sur la formation de nitrosamine au cours de la durée de conservation, lorsque la cause réside dans la dégradation du produit fini plutôt que dans la synthèse de l'API.
Ce que vous recevez
Un rapport technique interprété, pas un ensemble de chromatogrammes lâches.
Données et preuves
- Chromatogrammes et spectres de masse par nitrosamine testée
- Données de validation de méthode : spécificité, linéarité, exactitude, précision, LOD et LOQ
- Résultat quantitatif par composé, en concentration et en apport journalier estimé
- Comparaison directe avec la limite de dose journalière admissible applicable
Interprétation et conclusions
- Avis de conformité par rapport aux directives actuelles (ICH M7, FDA, EMA, ANVISA)
- Discussion sur la cause profonde lorsque le résultat indique un risque de synthèse, de processus ou de dégradation
- Recommandations d’atténuation ou d’ajustement du processus, le cas échéant
- Preuves organisées dans un format qui prend en charge la soumission réglementaire
Portée et redressement
Le champ d'application est axé sur les risques : l'évaluation documentaire définit quelles nitrosamines nécessitent une quantification expérimentale, en évitant des essais qui ne modifieraient pas la décision réglementaire.
- Évaluation documentaire des risques avant tout essai sur banc
- Périmètre analytique limité aux nitrosamines ayant un potentiel de formation identifié
- Une méthode validée avec une sensibilité tracée jusqu'à la limite d'apport acceptable du composé
- Résultats exprimés à la fois en concentration et en apport journalier estimé
- Adapté aux évaluations ponctuelles, aux études de routine sur la libération de lots et à la stabilité
Questions fréquemment posées
Que sont les impuretés nitrosamines ?
- Ce sont des composés N-nitroso formés lorsqu'une amine secondaire ou tertiaire réagit avec un agent nitrosant. Plusieurs nitrosamines sont classées comme cancérogènes probables pour l'homme, c'est pourquoi les agences de réglementation ont fixé des limites de dose journalière acceptables pour les produits médicamenteux.
Pourquoi les nitrosamines présentent-elles un risque dans les produits pharmaceutiques ?
- Parce qu'ils peuvent se former lors de la synthèse de l'API, par interaction entre l'actif, les excipients et l'emballage, ou par dégradation au cours du stockage, souvent à des concentrations très faibles qui peuvent encore dépasser la limite de dose journalière acceptable fixée par l'évaluation des risques toxicologiques.
Quels médicaments présentent le plus grand risque de contenir des nitrosamines ?
- Les sartans (losartan, valsartan, irbésartan) et la metformine représentent les cas les plus documentés, car ils contiennent ou génèrent des amines secondaires ou tertiaires par voie de synthèse. Des cas historiques concernaient également la ranitidine, par formation pendant le stockage plutôt que pendant la fabrication.
Quelle est la différence entre LC-MS/MS et GC-MS pour l’analyse des nitrosamines ?
- LC-MS/MS est utilisé pour les nitrosamines polaires et non volatiles, directement dans l'API ou dans la matrice du produit fini. La GC-MS avec échantillonnage de l'espace de tête est utilisée pour les nitrosamines volatiles, évitant ainsi l'extraction approfondie qu'une matrice complexe nécessiterait autrement. Le choix dépend de la nitrosamine cible et de la matrice.
Quelle est la limite journalière acceptable pour les nitrosamines ?
- Cela varie selon le composé : les valeurs de référence les plus citées incluent 96 ng/jour pour la NDMA et la NMBA, et 26,5 ng/jour pour la NDEA, la NDIPA, la NEIPA, la NMPA et la NDBA. Ces limites sont révisées périodiquement par les agences de réglementation et peuvent différer selon le produit ; l'évaluation applique toujours la valeur en vigueur dans les directives applicables au moment de l'étude.
L'ANVISA exige-t-elle des tests de nitrosamine ?
- ANVISA suit les directives internationales ICH M7 et exige une évaluation des risques liés aux impuretés génotoxiques, y compris les nitrosamines, dans le cadre des preuves de sécurité toxicologique pour les API et les produits finis enregistrés au Brésil.
Qu’est-ce qu’une évaluation des risques liés aux nitrosamines selon ICH M7 ?
- Il s'agit de la revue documentaire de la voie de synthèse de l'API, des précurseurs porteurs d'une amine secondaire ou tertiaire, des excipients, du procédé de fabrication et des conditions de stockage, pour classer le potentiel de formation de nitrosamine avant de décider si une quantification expérimentale est nécessaire.
Comment se forme une nitrosamine lors de la fabrication ou du stockage ?
- La voie la plus courante est la réaction d'une amine secondaire ou tertiaire, présente dans l'API, dans un excipient ou comme sous-produit, avec du nitrite résiduel dans des conditions acides. Les matières premières, solvants ou réactifs contaminés, ainsi que la dégradation du produit lui-même au cours de sa durée de conservation, sont également des voies documentées.
La méthode analytique doit-elle être validée pour chaque produit ?
- Oui. La validation confirme que la méthode est sélective par rapport à la matrice spécifique de ce produit et suffisamment sensible pour quantifier de manière fiable en dessous de la limite d'apport journalier acceptable de cette nitrosamine ; une méthode générique ne remplace pas cette vérification.
Combien de temps dure une étude d’analyse des nitrosamines ?
- Cela dépend du périmètre fixé après l'évaluation des risques : une quantification de routine avec une méthode déjà validée est plus rapide qu'une étude nécessitant un développement de méthode et une validation spécifique à la matrice du produit. Le redressement est fixé dans la proposition, après l’évaluation initiale des risques.
Les informations soumises sont-elles traitées de manière confidentielle ?
- Oui. La portée, les échantillons, les résultats et l'existence de l'étude sont traités comme des informations confidentielles du client, dans le cadre d'un accord de confidentialité signé avant l'envoi des échantillons.
Quels types de produits peuvent être analysés ?
- API, excipients, produits finis et échantillons pour études de stabilité. La portée analytique et la matrice d'extraction sont adaptées au type d'échantillon et à la nitrosamine cible identifiée dans l'évaluation des risques.
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