Nitrosamin-Analyse: Nachweis und Quantifizierung genotoxischer Verunreinigungen
Bei der Nitrosaminanalyse handelt es sich um den Nachweis und die Quantifizierung von N-Nitrosaminen im Spurenbereich, die in Wirkstoffen, Hilfsstoffen und Fertigarzneimitteln als wahrscheinlich krebserregend für den Menschen eingestuft sind. Die Studie kombiniert LC-MS/MS und GC-MS, um jedes Nitrosamin anhand seiner akzeptablen täglichen Aufnahmegrenze zu messen und so die ICH M7-Risikobewertung, Chargenfreigabe und behördliche Einreichung zu unterstützen.
Was ist eine Nitrosaminanalyse?
Nitrosamine sind N-Nitrosoverbindungen, die entstehen, wenn ein sekundäres oder tertiäres Amin mit einem Nitrosierungsmittel, restlichem Nitrit oder unter sauren Bedingungen erzeugten Nebenprodukten reagiert. Mehrere werden als wahrscheinlich krebserregend für den Menschen eingestuft, weshalb FDA, EMA und andere Aufsichtsbehörden eine Risikobewertung und, sofern gerechtfertigt, eine Quantifizierung auf Teile-pro-Milliarden-Ebene in Arzneimitteln verlangen.
Das Risiko beschränkt sich nicht nur auf die API-Synthese. Nitrosamine können auch durch Wechselwirkung zwischen Wirkstoff, Hilfsstoffen und Verpackungsmaterialien oder durch Abbau während der Lagerung entstehen. Der bekannteste Fall ist die NDMA-Bildung in Ranitidin über die Haltbarkeitsdauer hinweg, die nichts mit dem ursprünglichen Herstellungsprozess zu tun hat.
Die Analyse kombiniert zwei Ebenen: eine dokumentarische Risikobewertung, die identifiziert, ob der Syntheseweg, die Hilfsstoffe oder der Herstellungsprozess ein Bildungspotenzial schaffen, und eine analytische Ebene, die Massenspektrometrie-Quantifizierung im Spurenbereich, wenn das identifizierte Risiko eine experimentelle Bestätigung erfordert.
Überwachte Nitrosamine und Referenzgrenzwerte
Sieben bis acht Verbindungen machen die meisten bisher dokumentierten Regulierungsfälle aus. Jedes hat seinen eigenen Grenzwert für die akzeptable tägliche Aufnahme (AI), der auf der Grundlage einer Risikobewertung der Karzinogenität festgelegt wird.
| Verbindung | Name | Referenz-KI |
|---|---|---|
| NDMA | N-Nitrosodimethylamin | 96 ng/Tag |
| NDEA | N-Nitrosodiethylamin | 26,5 ng/Tag |
| NMBA | N-Nitroso-N-methyl-4-aminobuttersäure | 96 ng/Tag |
| NDIPA | N-Nitrosodiisopropylamin | 26,5 ng/Tag |
| NEIPA | N-Nitrosoethylisopropylamin | 26,5 ng/Tag |
| NMPA | N-Nitrosomethylphenylamin | 26,5 ng/Tag |
| NDBA | N-Nitrosodibutylamin | 26,5 ng/Tag |
In den FDA-Leitlinien am häufigsten genannte Referenzwerte. Die Grenzwerte werden regelmäßig überprüft und können je nach Regulierungsbehörde und Produkt variieren. Bei der Risikobewertung in der Studie wird immer der aktuelle Wert der geltenden Leitlinien zugrunde gelegt.
Von der Technik bis zur Entscheidung
Die Wahl der Methode hängt von der Flüchtigkeit und Polarität des Zielnitrosamins sowie von der Produktmatrix ab. Keine Technik gelangt in den Anwendungsbereich, ohne eine Frage zu beantworten, die in der Risikobewertung aufgeworfen wurde.
| Technik | Was es misst | Welche Entscheidung es unterstützt |
|---|---|---|
| LC-MS/MS | Polare, nichtflüchtige Nitrosamine im Spurenbereich, direkt im Wirkstoff, Hilfsstoff oder Endprodukt, der typische Fall für Sartane und Metformin. | Ob eine bestimmte Charge innerhalb der akzeptablen täglichen Aufnahmegrenze für das betreffende Nitrosamin liegt. |
| GC-MS (Headspace) | Flüchtige Nitrosamine durch Headspace-Probenahme, ohne umfangreiche Matrixextraktion. | Ob ein flüchtiges Nitrosamin vorhanden ist, ohne dass das Risiko einer Störung besteht, die eine Flüssigextraktion mit sich bringen würde. |
| Chromatographie · Unterstützung von HPLC/UPLC | Trennung des Zielnitrosamins von Hilfsstoffen und Abbauprodukten vor der Massendetektion. | Ob die Produktmatrix einen zusätzlichen Trennungsschritt erfordert, um ein falsches Negativ oder eine Signalunterdrückung zu vermeiden. |
| Validierung analytischer Methoden | Spezifität, Linearität, Genauigkeit, Präzision, Nachweisgrenze und Quantifizierungsgrenze der Methode im Vergleich zur realen Produktmatrix. | Ob die Methode empfindlich genug ist, um eine zuverlässige Quantifizierung unterhalb der akzeptablen täglichen Aufnahmegrenze und nicht nur unterhalb einer allgemeinen Laborgrenze zu ermöglichen. |
Der analytische Workflow
Jedes Produkt durchläuft den gleichen logischen Ablauf, wobei der Analyseumfang an das in der ersten Phase identifizierte Risiko angepasst ist; Nicht jedes bewertete Produkt erfordert eine experimentelle Quantifizierung.
Dokumentarische Risikobewertung (ICH M7)
Kritische Überprüfung der Syntheseroute des Wirkstoffs, der Vorläufer, die ein sekundäres oder tertiäres Amin tragen, potenzieller Nitrosierungsmittel, der Hilfsstoffe, des Herstellungsprozesses und der Lagerbedingungen. Klassifiziert das Nitrosaminbildungspotenzial des Produkts vor jedem Labortest.
Risikobewertungsbericht
Methodenentwicklung und -validierung
Eine LC-MS/MS- oder GC-MS-Methode, die spezifisch für das Nitrosamin und die Produktmatrix ist und eine Selektivität gegenüber dem Rest der Formulierung aufweist. Validierung der Spezifität, Linearität, Genauigkeit, Präzision und Sensitivität (LOD/LOQ) gemäß den geltenden regulatorischen Anforderungen.
Eine validierte Methode, deren Empfindlichkeit auf die akzeptable Aufnahmegrenze zurückgeführt wird
Bestätigende Quantifizierung
Quantifizierung im Spurenbereich jedes als Risiko gekennzeichneten Nitrosamins pro Charge oder pro Stabilitätsstudienpunkt, wobei das Ergebnis als Konzentration ausgedrückt und ausgehend von der maximalen Produktdosis in die tägliche Aufnahme umgerechnet wird.
Quantitatives Ergebnis pro Nitrosamin, in ng/g und ng/Tag
Interpretation und regulatorische Unterstützung
Vergleich jedes Ergebnisses mit der aktuell akzeptablen täglichen Aufnahmegrenze, ggf. Diskussion der Grundursache und Organisation der Beweise in dem für die Einreichung bei ANVISA, FDA oder EMA erforderlichen Format.
Ein interpretierter Bericht mit einer Compliance-Stellungnahme
Anwendungen
Die gleiche analytische Fähigkeit unterstützt unterschiedliche Bereiche von Risiko- und Regulierungsentscheidungen.
Syntheserisiko
APIs mit sekundären oder tertiären Aminen
Sartane, Metformin und andere Klassen, deren Syntheseweg oder regulatorische Geschichte den Wirkstoff bereits mit der Nitrosaminbildung in Verbindung gebracht hat.
Generika und Ähnliches
Registrierungsdossier und Chargenfreigabe
Quantitativer Nachweis auf Chargenebene zur Unterstützung der ANVISA- oder anderen behördlichen Registrierung und routinemäßigen Freigabe, wobei die Ergebnisse auf die akzeptable Aufnahmegrenze des Produkts zurückgeführt werden können.
CDMO und Vertragshersteller
Risikobewertung neuer Prozesse
Dokumentarische Beurteilung vor Beginn der kommerziellen Produktion, Identifizierung von Vorläufern und Prozessschritten mit Bildungspotenzial.
Stabilität
Bildung während der Lagerung
Untersuchung der Nitrosaminbildung über die Haltbarkeitsdauer, wenn die Ursache im Abbau des Endprodukts und nicht in der API-Synthese liegt.
Was Sie erhalten
Ein interpretierter technischer Bericht, kein Satz loser Chromatogramme.
Daten und Beweise
- Chromatogramme und Massenspektren pro getestetem Nitrosamin
- Methodenvalidierungsdaten: Spezifität, Linearität, Genauigkeit, Präzision, LOD und LOQ
- Quantitatives Ergebnis pro Verbindung, in Konzentration und in geschätzter täglicher Aufnahme
- Direkter Vergleich mit der geltenden akzeptablen täglichen Aufnahmegrenze
Interpretation und Schlussfolgerungen
- Compliance-Gutachten im Vergleich zu aktuellen Leitlinien (ICH M7, FDA, EMA, ANVISA)
- Diskussion der Grundursache, wenn das Ergebnis auf ein Synthese-, Prozess- oder Abbaurisiko hinweist
- Gegebenenfalls Empfehlungen zur Schadensbegrenzung oder Prozessanpassung
- Nachweise, die in einem Format organisiert sind, das die Einreichung bei Behörden unterstützt
Umfang und Turnaround
Der Umfang ist risikoorientiert: Die dokumentarische Bewertung definiert, welche Nitrosamine eine experimentelle Quantifizierung erfordern, und vermeidet Tests, die die regulatorische Entscheidung nicht ändern würden.
- Dokumentation der Risikobewertung vor jedem Laborversuch
- Der Analyseumfang ist auf Nitrosamine mit identifiziertem Bildungspotenzial beschränkt
- Eine validierte Methode mit Sensitivität, die sich an der akzeptablen Aufnahmegrenze der Verbindung orientiert
- Die Ergebnisse werden sowohl als Konzentration als auch als geschätzte tägliche Aufnahme ausgedrückt
- Geeignet für einmalige Beurteilungen, routinemäßige Chargenfreigaben und Stabilitätsstudien
Häufig gestellte Fragen
Was sind Nitrosamin-Verunreinigungen?
- Dabei handelt es sich um N-Nitrosoverbindungen, die entstehen, wenn ein sekundäres oder tertiäres Amin mit einem Nitrosierungsmittel reagiert. Mehrere Nitrosamine werden als wahrscheinlich krebserregend für den Menschen eingestuft, weshalb Aufsichtsbehörden akzeptable tägliche Aufnahmegrenzen für Arzneimittel festgelegt haben.
Warum stellen Nitrosamine in Arzneimitteln ein Risiko dar?
- Denn sie können während der API-Synthese, durch Wechselwirkung zwischen Wirkstoff, Hilfsstoffen und Verpackung oder durch Abbau während der Lagerung entstehen, oft in sehr geringen Konzentrationen, die immer noch die akzeptable tägliche Aufnahmegrenze überschreiten können, die in der toxikologischen Risikobewertung festgelegt wurde.
Bei welchen Arzneimitteln besteht das größte Risiko, Nitrosamine zu enthalten?
- Sartane (Losartan, Valsartan, Irbesartan) und Metformin sind für die meisten dokumentierten Fälle verantwortlich, da sie sekundäre oder tertiäre Amine auf dem Syntheseweg enthalten oder erzeugen. In historischen Fällen kam es auch zu Ranitidin, und zwar durch Bildung während der Lagerung und nicht während der Herstellung.
Was ist der Unterschied zwischen LC-MS/MS und GC-MS für die Nitrosaminanalyse?
- LC-MS/MS wird für polare, nichtflüchtige Nitrosamine direkt im Wirkstoff oder in der Fertigproduktmatrix eingesetzt. GC-MS mit Headspace-Probenahme wird für flüchtige Nitrosamine verwendet, wodurch die umfangreiche Extraktion vermieden wird, die eine komplexe Matrix sonst erfordern würde. Die Wahl hängt vom Ziel-Nitrosamin und der Matrix ab.
Was ist die akzeptable tägliche Aufnahmegrenze für Nitrosamine?
- Sie variiert je nach Verbindung: Zu den am häufigsten genannten Referenzwerten gehören 96 ng/Tag für NDMA und NMBA und 26,5 ng/Tag für NDEA, NDIPA, NEIPA, NMPA und NDBA. Diese Grenzwerte werden regelmäßig von den Aufsichtsbehörden überprüft und können je nach Produkt unterschiedlich sein. Bei der Bewertung wird immer der zum Zeitpunkt der Studie aktuelle Wert in den geltenden Leitlinien zugrunde gelegt.
Erfordert ANVISA Nitrosamintests?
- ANVISA folgt der internationalen ICH M7-Leitlinie und verlangt eine Risikobewertung genotoxischer Verunreinigungen, einschließlich Nitrosaminen, als Teil des toxikologischen Sicherheitsnachweises für in Brasilien registrierte Wirkstoffe und Fertigprodukte.
Was ist eine Nitrosamin-Risikobewertung gemäß ICH M7?
- Dabei handelt es sich um die dokumentarische Überprüfung des Synthesewegs des API, der Vorläufer, die ein sekundäres oder tertiäres Amin tragen, der Hilfsstoffe, des Herstellungsprozesses und der Lagerbedingungen, um das Nitrosaminbildungspotenzial zu klassifizieren, bevor entschieden wird, ob eine experimentelle Quantifizierung erforderlich ist.
Wie entsteht ein Nitrosamin bei der Herstellung oder Lagerung?
- Der gebräuchlichste Weg ist die Reaktion eines sekundären oder tertiären Amins, das im API, in einem Hilfsstoff oder als Nebenprodukt vorhanden ist, mit restlichem Nitrit unter sauren Bedingungen. Verunreinigte Rohstoffe, Lösungsmittel oder Reagenzien sowie die Zersetzung des Produkts selbst während der Haltbarkeitsdauer sind ebenfalls dokumentierte Wege.
Muss die Analysemethode für jedes Produkt validiert werden?
- Ja. Die Validierung bestätigt, dass die Methode selektiv gegenüber der spezifischen Matrix dieses Produkts und empfindlich genug ist, um zuverlässig unterhalb der akzeptablen täglichen Aufnahmegrenze dieses Nitrosamins zu quantifizieren. Eine generische Methode ersetzt diese Prüfung nicht.
Wie lange dauert eine Nitrosamin-Analysestudie?
- Dies hängt vom nach der Risikobewertung festgelegten Umfang ab: Die routinemäßige Quantifizierung mit einer bereits validierten Methode ist schneller als eine Studie, die eine Methodenentwicklung und -validierung speziell für die Produktmatrix erfordert. Nach der ersten Risikobewertung wird im Vorschlag eine Trendwende festgelegt.
Werden die übermittelten Informationen vertraulich behandelt?
- Ja. Umfang, Proben, Ergebnisse und die Existenz der Studie werden als vertrauliche Kundeninformationen im Rahmen einer Vertraulichkeitsvereinbarung behandelt, die vor dem Versand der Proben unterzeichnet wird.
Welche Produkttypen können analysiert werden?
- Wirkstoffe, Hilfsstoffe, Fertigprodukte und Stabilitätsstudienproben. Analyseumfang und Extraktionsmatrix werden an den Probentyp und das in der Risikobewertung identifizierte Zielnitrosamin angepasst.
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Der Umfang ist risikoorientiert: Die dokumentarische Bewertung definiert, welche Nitrosamine eine experimentelle Quantifizierung erfordern, und vermeidet Tests, die die regulatorische Entscheidung nicht ändern würden.
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